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第二节 老年性痴呆动物模型及其评价（第2页）

（三）Aβ灌注模型

鉴于Aβ的神经毒性作用，研究者将思路转向了Aβ的脑内灌注，并在脑内沉积，以观察是否能复制出痴呆模型。1991年Kowall将Aβ注入动物脑中，导致神经元变性。1992年Kowall又报道了他们的实验结果，在实验动物脑注射部位可见局灶性坏死，神经元缺失和胶质增生。1991年SallyA等将Aβ注射入海马以造成痴呆模型，刚果红染色检验发现注射部位有染色阳性物质沉淀，银染显示有营养不良性轴突出现，注射Aβ1个月后，海马中肉眼可见明显的神经元丢失，尤其在齿状回。1995年至1996年，等用微型渗透压泵给大鼠大脑脑室内灌注Aβ，经水迷宫和被动回避试验证实大鼠认知功能受到损害，并且大脑前端皮质和海马内胆碱乙酰转移酶活性明显下降，这些结果显示Aβ灌注导致了中枢神经系统功能障碍。1996年GiancaloPepeu等给大鼠基底核（NB）注射Aβ（1～40）多肽，经Nissel染色及Aβ免疫反应确定注射部位有斑块形成，同时伴随胆碱能功能减退，基底核胆碱能神经元减少，Ach释放减少。脑内急性注射Aβ可使动物产生与AD相似的行为障碍和记忆缺损症状，并出现Aβ沉积。所以，急性注射Aβ目前是一种较好的动物模型，常采用的方法有海马内单点注射、海马内多点注射等。1997年Alvarez等单侧和双侧海马注射Aβ1～28片段（2μl，5nmolμl），行为实验结果表明：注射后，Aβ降低精神运动协调能力，同时被动回避实验显示：Aβ注射后损伤了学习获得能力，降低了被动回避次数。以上的结果显示Aβ灌注与学习记忆功能损伤和神经元变性及缺失有关。

四、AD转基因动物模型

人们发现AD基因突变的同时，便开始借助新出现的转基因技术，将已发现的人类的4个突变的外源性基因转入动物体内来制备转基因动物模型，这已成为动物模型制作中一个较新的方法，该方法将FAD相关的人类突变基因转入动物中，并使外源性基因稳定遗传，改变动物遗传学性状，达到在动物体内模拟人类FAD遗传特征的目的，并以此来筛选针对Aβ靶点的AD治疗药物。1993年，第23届美国神经科学年会上Felenstein宣布建立了转基因大鼠，1995年美国一家公司宣布建立了转基因小鼠模型，随后各国科学家也分别建立了不同的转基因动物模型。模型以遗传学说为基础，常用的转基因动物模型是用实验的方法将外源性基因如ＡPP基因（野生型或突变型）导入，使其在染色体基因组中稳定整合、表达，并遗传给后代。动物过多地表达ＡPP基因或其突变产物，引起Ａβ的沉积和相关的病理损害或临床症状。

与AD相关的基因包括位于21号染色体上的β-淀粉样前体蛋白（APP）基因、位于14号染色体上的早老素-1（PS-1）基因和位于1号染色体上的早老素-2（PS-2）基因、与AD发病相关的危险因素有位于19号染色体上的载脂蛋白E（ApoE）基因、Ｔau蛋白基因，其中，位于21号染色体长臂上的APP基因经水解可生成Aβ分子，其717位密码子的突变最为常见。常用的转基因动物模型制备的简单程序如下：①引物的设计或靶基因的制备。②重组靶基因注入受精卵。③植入假孕受体。④检测与评价。大部分的转基因动物模型都能复制出AD病人的部分神经病理特征如细胞外Aβ沉积，营养障碍性神经炎症成分，神经胶质增生等。而且，较完善的转基因动物模型还可观察到学习记忆行为障碍。转基因动物的最大优点是模拟了AD样神经病理学的特征，包括细胞外Aβ的沉积、营养障碍导致的神经炎性斑块、胶质细胞增生；该模型正越来越受到关注。

转基因是将外源性基因引入基因组，并使外源性基因稳定遗传的方法。转基因动物可在体内研究某一特定致病基因的作用，是研究AD独特而重要的模型。转基因动物分为两类，第一类是含有无效基因的小鼠—基因敲除鼠。它们通常用于了解敲除的基因在AD病因中的功能，与此同时它们可以再插入相关的人类突变型基因，以避免内源性小鼠基因可能的干扰作用。笫二类是AD转基因小鼠表达AD突变的致病基因，从而表现出相关的AD表型的病理特征，通过对已存在的AD转基因小鼠相杂交，附加额外的基因或因此来创造转双基因或多基因的小鼠。这样使得人们能对这些不同AD相关因素的相互作用进行研究。基予遗传背景、繁殖能力、操作难度和经济等方面考虑，目前的转基因动物多选用小鼠。现有多种转基因小鼠均可表达与AD病变有关的基因如APP、APP的C末端片段、Tau、PS1、PS2、ApoE等。

（一）APP和PS转基因小鼠

1。Aβ沉积

早期发病的AD在整个AD病人中所占的比例较少，主要发生于30～60岁，通常带有家族性。FAD中已发现了3个基因的突变能导致AD，即APP、PS1和PS2基因。

2。Tau的改变

采用银染的方法对转APP和PS基因小鼠已存在的神经纤维进行分析，在过度表达PSI和APP的FAD等位基因小鼠中，没有检测到NFT。然而，在一些鼠系出现了NFT的早期改变—Tau的高度磷酸化。在Thyl-APPswe小鼠中，采用Tau抗体对几个磷酸化表位进行确认，发现扭曲的轴突含有高度磷酸化Tau。NSE-APP751小鼠也有报道显示出Alz5O染色阳性。

3。营养障碍轴突、神经元损失和反应性胶质增生

在PrP-APPswe小鼠中，用Gallyas银染的方法发现斑的邻近区域存在营养障碍轴突。PDAPP小鼠中使用抗突触素的抗体观察到的扭曲轴突与AD病人中的轴突改变相似，其营养障碍轴突具有密集的板状体和神经丝的聚集，具有ADⅠ型营养障碍轴突特征。Sturchler-Pierrat使用特定的方法也观察到扭曲的轴突围绕着Aβ沉积的核心，发现局部有一个扭曲的AchE阳性纤维，而目目前已知，AD病人中胆碱能神经元是严重受损的。突触的损失和神经元的死亡是AD的典型特征。

4。记忆力障碍

在小鼠的行为学研究中，Morris水迷宫经常被用来检测空间参考记忆；Y迷宫去检测空间近期记忆；而放射状迷宫用来检测空间工作记忆。采用这些测试方法，在APP转基因小鼠上发现学习和记忆障碍。

（二）Aβ和C100或104转基因小鼠

转基因小鼠也通过使用Aβ，100或104个氨基酸的APP片段来产生。CI00是β分泌酶剪切APP的产物，能够被γ分泌酶所水解而产生C端的Aβ。FVBN转基因小鼠过度产生Aβ1-42，表现在整个皮质、齿状回、丘脑和后脑的神经元都有Aβ的免疫反应。用TUNEL染色方法检测到神经细胞凋亡和神经细胞发生的变性。推测可能是过多的Aβ1-42直接引起了神经的变性和凋亡，导致这些小鼠身上所观察的神经学上的异常，但也可能是FVBN遗传背景产生的特殊表现。

（三）载脂蛋白E小鼠

ApoE4是与AD相关联的危险因素。ApoE4对含有APP突变的FAD有促进作用，但对具有PS突变的FAD却没有作用。ApoE4与AD的发病相关联不仅在病例对照研究中所支持，而在以家族性AD为基础相关研究中也得到支持。现在认为，晚期发病的AD形式（发生于65岁以后）更为普遍，这类AD病人的发病主要是与ApoE4有关，认为其参与了β淀粉样斑的形成。含有ApoE4表型的AD病人大脑中Aβ40和Aβ42免疫反应斑的水乎都比不含有ApoE4表型的AD病人的水平要高。

缺乏ApoE的小鼠与PDAPP小鼠杂交的后代表现出Aβ沉积显著的减少。ApoE敲除小鼠的记忆障碍和胆碱能神经元异常表明了ApoE和AD之间的另外一种联系。携带有ApoE4等位基因的AD个体中，观察到AchE神经元的的减少。而缺乏ApoE的小鼠，通过生物化学和免疫组织学测量发现其海马与皮质中的AchE活性下降；其在Morris水迷宫的工作记忆下降。这种在Morris水迷宫中的空间工作记忆障碍和胆碱能标记物的下降能够被M1激动剂治疗3周所逆转。

（四）Tau基因小鼠

AD两大病理改变除了SP外，另一个是NFT，其是由高度磷酸化的微管相关蛋自Tau构成的。正常的情况下，Tau蛋白分布于轴突，结合微管和聚合的微管蛋白，在轴突微管之间建立短的连接桥。在AD病理条件下，Tau被磷酸化重新分布于胞体和胞体树突室，在那里聚集形成丝状物（pairhelicalfilaments，PHFs）。在疾病的晚期阶段，这些丝充满整个神经元胞体（neurles，NFT）。SP和NFT能各自独立的发生，由Tau蛋白聚集形成的纤维缠结，在一些情况下与那些普通神经变性疾病中的纤维缠结难以区别，但在这些普通神经变性疾病中几乎没有发现含有Aβ沉积物和SP。相反的，Aβ的沉积物能在认知功能正常的老年人中发现，但却没有纤维缠结的发生。也有一些不常见的AD病理是“纤维缠结稀少“的类型，即很少的NFT而有丰富的Aβ沉积斑。由磷酸化Tau构成的NFT存在于一些不含SP的神经退行性疾病，如Pick‘s病、渐进性核上性麻痹、皮质基底退行性疾病和17号染色体相关联的帕金森综合征额颞叶痴呆。这些疾病的NFT分布不像AD只发生于神经元内，还分布于胶质细胞中。表现人类Tau蛋白的转基因小鼠是用人类Thy-1作为启动子，将带有表达人类Tau蛋白的基因注射到受精卵中，植入假孕的母鼠体内，生产的小鼠带有此基因段。转基因小鼠Tau蛋白mRNA表达水平是内源性的5倍，且发现与AD相似部位存在有过度磷酸化Tau蛋白。尽管未发现NFT，但此种模型仍适合AD治疗药物的筛选，并为有NFT形成的转基因模型奠定基础。

（五）其他的可用于制备转基因小鼠的基因

有报道其他的一些基因与AD的发病相关联，但大部分却是一个互相矛盾的数据。例如，有研究报道认为a1-抗凝乳蛋白酶与AD有关，而另外的研究却反对。对于极低密度脂蛋白受体、丁酰胆碱脂酶和低密度脂蛋白受体病例对照研究的结果也是互相冲突。如果这两个与AD有关联的基因能导入HLA-A2等位基因，将会给我们提供有用的信息。虽然TGF-β1在遗传学上与AD没有什么联系，但它在大脑损伤反应中扮演一个中心角色，小鼠大脑中的星形胶质细胞增生反应时过度表达TGF-β1。hAPP和TGF-β1双转基因小鼠在2～3个月时，大脑就出现了硫磺素S和Aβ免疫组化染色阳性，与大脑淀粉样血管病变相似。而仅表达hAPP对照小鼠在2～3个月时却没有观察到沉积，过度表达TGF-β1小鼠对hAPP的水平也没有影响。如果新的与AD发病有关的基因被确立，将会复制出具备更精确AD病理和症状的转基因动物。

转基因动物模型脑内出现了AD特有的病理改变Aβ沉积和SP，而FTDP-17突变Tau基因小鼠出现了Tau的病理改变，特别是NFT的形成，在AD动物模型方面取得了巨大的进步，为针对SP和NFT方面的新药筛选提供了良好的动物模型。但建立转基因动物模型需要复杂的技术和高昂的费用，这类模型缺乏一个衰老过程，不能完全具备理想AD动物模型特征，鼠系的遗传背景之间的差异导致同一类转基因鼠出现差异，重复性较差。因此，转基因模型要进一步推广应用，尤其是在新药筛选和药理毒理学研究方面将受到很大局限。

尽管AD与人体第21号、19号和14号染色体有关，但目前研究最多并且利用于制备动物模型的基本定位于第21号染色体上。自从1991年美国3个实验室几乎同时报道用转基因技术诱发鼠脑淀粉样病变获得成功，在美国AD界引起极大震动以来，用转基因动物模型来研究AD获得极大发展。转基因动物的最明显的优点是模拟了AD样神经病理学特征，包括细胞外Aβ的沉积，营养不良性神经炎成分，神经胶质增生。转基因小鼠可能提供一个分析Aβ沉积机制和验证AD的治疗药物的动物模型。但目前该模型也存在许多不足，有待进一步研究。

五、慢性缺血痴呆模型

脑的供血不足可以导致脑损伤和一系列的临床症状。加拿大学者Torre报告用老年动物制作慢性脑缺血模型引起的行为缺失和脑组织病理生理改变在许多方面与人类的老年期痴呆相类似。水迷宫测试显示空间记忆能力明显下降，病理学检查证实，神经元丢失、胶质纤维酸性蛋白免疫反应增强。该模型可用于开发记忆障碍药物的临床前筛选，但该模型出现的神经病理学改变广泛，不仅限于ＡＤ的表现，限制了它的应用。

临**有不少老年性痴呆患者同时合并有脑血管性痴呆和脑供血不足，该模型适用于研究混合型老年性痴呆的发病机制和有关药物治疗的研究。

六、以AD发病的环境因素为基础的动物模型

并不是所有的AD患者都具有阳性家族史，真正有基因改变的患者所占的比例并不高，相当一部分患者从遗传学上找不到任何线索，因此外界环境危险因素在AD发病中也占有重要的地位。目前人们已发现一些环境因素能引起AD患者发病率升高。大体上包括生物因素（如病毒感染、高血压、糖尿病等）、物理因素（如脑外伤等）和化学因素（如铝元素含量过高）。目前只有铝元素与AD发病间的关系研究的比较多，并以此建立了铝元素慢性中毒的AD动物模型。

铝与AD有关的理论来自许多实验研究，其中最有意义的证据就是：AD患者脑组织铝含量水平较高及近年来发现的铝可导致脑组织神经原纤维缠结和老年斑的形成。铝具有神经毒性，张雪飞等采用AlCl3造成大鼠痴呆模型，发现大鼠在一次性被动回避反应中潜伏期缩短，他们认为铝可导致神经原纤维变性，大脑皮质萎缩，从而推断铝对形成痴呆有直接作用。动物实验结果表明，无论经何种方式给以铝化物，都可见到动物脑铝含量明显升高，并且在行为学上出现一系列的行为异常，动物出现记忆和认知障碍。给家兔脑内注射铝可产生神经纤维缠结和被动学习障碍，并可产生迟发性的记忆和认知损伤。1996年莫启忠、宫斌等的三氯化铝拟痴呆模型显示：拟痴呆小鼠大脑皮质中胆碱酯酶活性比正常青年组小鼠明显提高，而M-受体结合容量值明显降低。1998年秦红友等通过小鼠三氯化铝灌胃制备了拟痴呆模型，避暗法显示小鼠逼暗反应记忆能力明显下降。结果显示本模型部分模仿了老年痴呆的胆碱能神经系统功能下降及记忆力减退的特征。但有报道称：用铝造成的动物模型形成的神经纤维缠结与AD患者有明显的不同，且中枢胆碱能活性正常。因此，用铝是否能造成AD模型还需进一步研究。此种动物模型形成的神经原纤维缠结中Ｔau蛋白没有磷酸化成PHF，且中枢胆碱能活性正常，因此，该模型不是较好的AD动物模型。

七、实验性自动免疫痴呆（EAD）模型

中枢学习记忆功能和免疫功能随增龄而发生的进行性衰退是机体衰老的两大特征。AD病人不仅表现有外周免疫功能紊乱，近年来研究发现其脑内形成的老年斑、神经原纤维缠结及神经元的丢失被认为与脑内发生的自身免疫损伤具有密切的关系。免疫学研究发现AD患者血清和脑脊液中含有抗胆碱能神经元抗体，提示自身抗胆碱能神经元抗体可能是引起胆碱能神经元损伤的一个原因。Mi实验室从电鳐电叶中分离提取出胆碱能神经高分子量神经微丝蛋白，用其免疫大鼠，动物出现学习记忆功能衰退，前脑胆碱能神经元明显减少。另一个重要发现，就是在ＡＤ脑内发现存在补体激活并形成膜攻击单位，被认为是造成神经损伤的重要原因之一。此外，在中枢神经系统内发现存在多种细胞因子及其受体，如TNF、TGFs、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6等，主要由小神经胶质细胞和星形细胞分泌，它们参与脑内的炎性反应和AD脑内病理学特征的形成。Harrwig（1995）认为免疫衰老过程中，自身反应Ｔ细胞激活，通过血脑屏障进入脑内，激活小神经胶质细胞，诱导AD脑内的炎性神经毒性过程。上述发现提示，AD病人脑内的自身免疫损伤是引起AD脑内特征性病理变化的重要原因之一。基于AD的自身免疫学说，许多实验室采用多种自身免疫动物模型来研究AD的发病机制，并开始用于ＡＤ药物筛选。1997年莫启忠、宫斌等从神经-内分泌-免疫网络的理论出发，认识到免疫应答可以反馈调节神经系统功能，因此用SRBC免疫老年大鼠，观察到SRBC通过免疫应答的负反馈作用，明显降低了老年大鼠的记忆力，并且SRBC免疫可使老年大鼠皮质、海马和纹状体中的M和β受体结合容量显著降低，且明显低于老年对照组。本实验模仿了胆碱能功能低下型痴呆模型的部分特征。研究结果表明自身免疫动物模型表现出与衰老有关的神经免疫、神经病理及行为特征，学习记忆功能低下的程度与自身免疫损伤的程度成正相关。Sakic等建立了自身免疫MRL-Ipr小鼠模型，发现年轻的自身免疫MRL-Ipr小鼠在学习记忆能力及情感等方面与对照组相比要差得多，学习记忆能力的低下程度与自身抗体的产生及淋巴细胞渗透进入脑内的程度成正比。此后，他又将MRL、NZB、BXSB品系小鼠杂交，建立了一种系统红斑狼疮样的自身小鼠模型，通过主动回避反应实验表明，模型小鼠学习记忆功能衰退与自身免疫的程度成正比，两者密切相关。此外，其他品系的自身免疫病模型小鼠如BXSB、NZB×NZWF1、NXRF也同时表现有学习记忆功能明显缺陷。由于AD脑内免疫损伤现象的发现，使自身免疫发病机制的研究受到重视，自身免疫动物模型的研究正成为新的热点。

八、复合式AD动物模型

建立理想的老年性痴呆的动物模型可以更好地研究老年性痴呆的发病机制，也是进行老年性痴呆病理研究和药物开发的关键问题，但是，目前尚无一能全面再现、模拟老年性痴呆病理、生化、行为学等方面的全部特征的ＡＤ动物模型。现在，有学者提出，集多种因素于一体的复合式动物模型可能会表现出更为典型老年性痴呆的病理及行为学表现，为老年性痴呆的研究提出了值得深入探索的方向。

复合式AD动物模型，是在现有模型的基础上，利用综合两种或两种以上模型方法获得的一种复合模型。这类模型可以综合获得各种已有模型特点，符合AD的多因素发病机制。目前有的动物模型将Aβ（1～40或25～35）和小剂量的IBO共同注入大鼠海马，2周后除出现神经元大量丢失外，注射点附近以及包括CA1，CA2和部分脑回在内的脑区出现多数神经元异常；采用D半乳糖和A1C13合并制备的AD模型呈现了整体衰老、学习记忆功能下降、胆碱能系统功能减退、脑组织β-APP，PSl，BACE基因表达明显增强，脑组织出现Aβ沉积并有类SP形成，成功地模拟了AD的发病及病理特征。就现有AD动物模型而言，由于没有一个完全模拟AD特征的动物模型，单一模型只模拟AD部分病理改变，把各种制作单一模型的方法加以组合来模拟AD复杂的病因是制备AD模型的一个比较实际而有效方法。